Identification of Genes in Positive Alleles Marking Type 2 Diabetes Mellitus Using Primer A18 Identifikasi Gen pada Alel Positif Penanda Diabetes Melitus Tipe 2 Menggunakan Primer A18 Firda Aminatul aminatulfirda29@gmail.com Mushlih Miftahul mif.mushlih@umsida.ac.id Indonesia Indonesia 30 10 2021 Pendahuluan

Diabetes Melitus merupakan penyakit metabolisme yang ditandai dengan meningkatnya kadar glukosa dalam darah melebihi batas normal. Menurut International Diabetes Federation, terdapat sekitar 463 juta orang dewasa (usia 20-79 tahun) menderita Diabetes Melitus dan diperkirakan pada tahun 2024 penderita diabetes melitus akan meningkat menjadi 700 juta jiwa [1]. Diabetes Melitus Tipe II adalah suatu kelainan metabolik yang ditandai dengan adanya hiperglikemia akibat gangguan sekresi insulin dan resistensi insulin Diabetes Melitus Tipe II sendiri bisa disebabkan karena genetik dan juga gaya hidup atau lingkungan.

Analisa genetik penanda Diabetes Melitus Tipe 2 dibutuhkan untuk mengetahui keterlibatan genetik sebagai faktor resiko penyakit Diabetes Melitus Tipe 2 yang berguna untuk strategi pencegahan terhadap keturunan penderita Diabetes Melitus Tipe 2 sehingga faktor- faktor pemicu penyakit dapat dihindari sejak dini. Dalam penelitian Zahid, melakukan analisis untuk menemukan penanda DNA yang terkait dengan Diabetes Melitus tipe 2 dengan menggunakan 16 primer (A10, A13, A18, C5, C19, E2, E7, E13, F13, N16, O20, R1, R2, R3, dan R4) dengan metode PCR-RAPD [2]. Didapatkan hasil pada primer A18 menghasilkan pita DNA polimorfik dan memiliki nilai diskriminatif sebesar 25%. Hal ini menandakan bahwa primer A18 merupakan primer yang dapat menunjukkan polimorfisme.

Penelitian Sari, mampu menganalisis perbedaan polimorfisme pada penderita Diabetes Melitus Tipe 2 menggunakna metode RAPD [3]. Didapatkan perbedaan signifikan antara sampel Diabetes Melitus Tipe 2 dengan non Diabetes menggunakan primer A18 menghasilkan beberapa fragmen yang berbeda, yaitu terlihat polimorfisme pada panjang band 319 bp (p: 0.035) bpd an 18434 (p: 0.004) bp dengan p value <0.05. metode RAPD tidak menunjukkan gen yang terlibat, sehinggga belum diketahui gen yang spesifik. Oleh karena itu pada penelitian ini untuk menganalisis lebih lanjut agar dapat mengidentifikasi gen apa yang terlibat pada alel positif penanda Diabetes Melitus Tipe 2 yaitu pada band 319 bp menggunakan primer A18 metode Sequencing DNA.

 Metode Penelitian

Penelitian ini menggunakan desain deskriptif eksploratif yang dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler, Fakultas Ilmu Kesehatan Universitas Muhammadiyah Sidoarjo, sedangkan untuk proses sequencing dilakukan di Genetika Science Indonesia kota Tanggerang. Sampel yang digunakan adalah 2 sampel darah penderita Diabetes Melitus Tipe II dari desa Taman dan Balongbendo Sidoarjo, dan 8 sampel koleksi isolasi DNA yang memiliki penanda molekuler pada band 319 bp di Laboratorium Biologi Molekuler Fakultas Ilmu Kesehatan Universitas Muhammadiyah Sidoarjo. Teknik pengambilan sampel dengan teknik Purposive Sampling yaitu menggunakan kriteria khusus penderita diabetes melitus tipe 2 yang dibuktikan dengan surat dokter, pasien bersedia sebagai subjek penelitian, dan sampel hasil isolasi DNA penderita Diabetes Melitus Tipe II dengan penanda molekuler pada band 319 bp.

Pengambilan sampel penderita Diabetes Malitus Tipe 2 dilakukan dengan cara makrosampling pada pembuluh darah vena, darah diambil sebanyak 3cc. sampel darah yang sudah disiapkan dilakukan proses isolasi DNA untuk didapatkan DNA murni dengan menggunakan Genomic DNA Mini Kit Blood dengan protokol standart GeneAid. Kemudian dilakukan pengukuran kualitas DNA secara kualitatif dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa 2% yang kemudian divisualisasikan dengan menggunakan uv transiluminator untuk dilihat pita DNA nya. Setelah itu dilakukan uji kualitas DNA secara kuantitatif dengan menggunakan spektrofotometer UV Vis Doube Beam untuk didapatkan konsentrasi dan kemurnian DNA hasil isolasi. Proses PCR dilakukan dengan volume total 35 µL dengan komposisi 5 µL DNA genom, 3 µL primer A18 (5’- AGGTGACCGT-3’), 9 µL ddH2O, dan PCR mix 18 µL. Proses PCR RAPD dilakukan dengan menggunakan Biorad T100 thermocycler dengan pengaturan program reaksi PCR meliputi, pre- denaturasi 95˚C selama 5 menit; denaturasi 95˚C 1 menit; annealing 36˚C selama 1 menit; elongasi 72˚C selama 2 menit; dan post elongasi 72˚C selama 2 menit sebanyak 45 siklus. Produk PCR kemudian dilakukan proses elektroforesis gel agarosa 2% untuk diketahui band target nya yaitu pada band 319 bp. Selanjutnya dilakukan perhitungan untuk memperoleh band target dengan menggunakan Ms.Excel. Hasil pita DNA target dilakukan proses sequencing untuk dilakukan penerjemahan basa nukleotida yang kemudian dilakukan pencarian kesamaan urutan DNA (homology alignment) dengan gen yang terkait diabetes melitus tipe II dengan menggunakan BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) pada data GenBank dalam National Center for Biotechnology Information (NCBI).

 Hasil dan Pembahasan

A. Identifikasi Alel

Gambar 1. Hasil Visualisasi Elektroforesis

Keterangan : A1= sampel kode A1; A2= sampel kode A2; 1= F2; 2= F4; 3= F6; 4= F8; 5=10Q; 6= 2(4); 7= 13Q; 8= 14Q; M= Marker

Gambar 1 hasil visualisasi pada sampel A1, A2, F2, F4, F6, F8, 10Q, 2(4), 13Q, 14Q terlihat pita DNA yang menandakan hasil isolasi sudah benar dan dapat dilakukan uji selanjutnya. Namun hasil masih terlihat smear atau noda yang terbentuk karena adanya kontaminasi, terjadinya degradasi atau fragmentasi DNA pada saat isolasi [4]. Kualitas dan kuantitas DNA dipengaruhi oleh proses pengolahan nya yakni proses isolasi DNA [5]. Kualitas DNA yang rendah menandakan bahwa masih adanya komponen lain selain DNA pada hasil DNA template. Namun hasil elektroforesis tersebut sudah cukup menandakan keberadaan DNA pada sampel hasil isolasi.

Hasil Uji Kuantitatif DNA

Kode Sampel A(λ=260 nm) A(λ=280 nm) Konsentrasi DNA (ng/µL) Kemurnian
A1A213(Q)F2F8F62(4)10Q14QF4 0,5700,5820,3840,4480,6761,3040,5350,6210,870,615 0,3780,3780,2340,2940,4491,0870,3270,4110,5440,426 256,568261,843173,006201,495304,044586,817240,894279,303391,566276,77 1,5071,5411,641,5221,5051,21,6391,5081,5981,443
Rata- rata 297, 23 1,5103

Berdasarkan Tabel 2, didapatkan rata-rata nilai konsentrasi sampel sebesar 297,23ng/µL, banyak atau sedikitnya konsentrasi DNA dipengaruhi oleh rusaknya DNA pada saat isolasi atau adanya kontaminasi [6]. Syarat konsentrasi DNA yang baik yaitu minimal 50 ng/µL, hal ini menandakan bahwa hasil konsentrasi DNA yang diperoleh telah memenuhi syarat. Nilai kemurnian yang baik adalah yang memiliki nilai perbandingan A260/A280 berkisar antara 1,8- 2,0. Dalam Tabel 2, diperoleh rata-rata kemurnian DNA sebesar 1,5103, hal ini berarti DNA yang telah diperoleh masih terdapat kontaminasi berupa protein yang dibuktikan dengan didapatkan perbandingan nilai absoransi kurang dari 1,8. Adanya kontaminasi dipengaruhi pada saat proses isolasi DNA, baik saat proses pelisisan sel ataupun pada saat ekstraksi. Dengan hasil kemurnian tersebut, DNA hasil isolasi masih bisa digunakan untuk proses selanjutnya, yaitu proses PCR-RAPD (Polymerase Chain Reaction- Random Amplified Polymorphic DNA) karena pada proses PCR-RAPD tersebut tetap akan melakukan amplifikasi atau perbanyakan DNA oleh primer A18 walaupun dengan kemurnian yang rendah.

Proses PCR-RAPD (Polymerase Chain Reaction-Random Amplified Polymorphic DNA) menggunakan primer A18 dengan urutan nukleotida 5’-AGGTGACCGT-3’. Hasil proses PCR berupa pita DNA yang divisualisasikan dengan menggunakan uv transiluminator.

Gambar 2. Hasil Visualisasi Elektroforesis Pita DNA Produk PCR Primer A18

Keterangan :M = Marker DNA Ladder 100-1000 bp; A1 = Sampel kode A1; A2 = Sampel kode A2; 1= 13(Q); 2 = F2; 3= F8; 4= F6; 5= 2(4); 6= 10Q; 7= 14Q; 8= F4

Gambar 2 terlihat pita DNA produk PCR pada 8 sampel koleksi isolasi lebih samar daripada pita DNA yang terlihat pada sampel A1 dan A2 (sampel baru). Hal ini bisa terjadi karena sampel yang disimpan terlalu lama. Oleh karena itu, maka 8 sampel isolasi DNA tersebut tidak dilakukan proses lanjutan untuk sequencing.

B. Identifikasi Alel

Sequencing DNA dilakukan dengan melakukan pemotongan band target 319 bp untuk selanjutnya diterjemahkan basa nukleotidanya. Hasil sequencing berupa kromatogram dilakukan proses editing ke dalam format fasta lalu dilakukan pencarian kesamaan gen (Homology Alignment) di BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) pada GenBankNCBI (National Center For Biotechnology Information).

Kromatogram sampel A1 (Gambar 3) dilakukan editing pada dua wilayah peak yaitu antara 70-130 dan pada wilayah 180-270.Pemilihan wilayah tersebut dilakukan berdasarkan kualitas peak yang didapatkan, yaitu yang memiliki peak lebih tertata dan tidak timpang tindih serta memiliki puncak yang tinggi (tidak landai) dan saling terpisah dengan yang lain.

Gambar 3. Kromatogram hasil Sequencing sampel A1 Primer A18

Ket : = sekuen nukleotida yang dilakukan pemotongan/ editing pada wilayah peak 70-130; = sekuen nukleotida yang dilakukan pemotongan/ editing pada wilayah 180-270

Gambar 4. Hasil keselarasan urutan basa yang signifikan antara sekuen sampel penelitian dan sekuen dari data GenBank.

Berdasarkan Gambar 4 menjelaskan bahwa sekuen sampel A1 memiliki kemiripan dengan gen GATB (Glutamyl-tRNA Amidotransferase Sub Unit B). Total score merupakan jumlah dari nilai yang diperoleh dari sekuen yang memiliki kesamaan [7]. Dari hasil score tersebut didapatkan sebesar 71,6 untuk wilayah sekuen 70-130, hal ini menandakan bahwa hasil BLAST pada sekuen sampel tersebut reliable karena memiliki total score lebih dari 50 [8]. Sedangkan untuk total score pada wilayah sekuen 70-130 didapatkan sebesar 45,4. Query converence merupakan nilai presentase sekuen yang memiliki kesamaan ketika disejajarkan dengan data sekuen di GenBank. Pada sekuen sampel ini didapatkan nilai query converence masing- masing wilayah sekuen sebesar 81% dan 58%. Selanjutnya didapatkan nilai percentage of identity masing- masing sebesar 88,89% dan 80%, dari hasil tersebut dapat diartikan bahwa hasil reliable. Batas nilai dikatakan memiliki kemiripan adalah jika nilai % identitasnya tidak kurang dari 25%. Semakin tinggi nilai e-value maka semakin rendah pula tingkat kesamaan antar sekuen, begitupun sebaliknya [9]. Dalam hasil BLAST pada wilayah sekuen 70-130 diperoleh nilai e-value 4e-11, hal tersebut menunjukkan nilai yang rendah artinya hasil penjajaran identik. Sedangkan pada wilayah sekuen 180- 270 diperoleh nilai e-value 0,009, hal ini menunjukkan hasil penjajaran dengan hasil BLAST semakin signifikan karena memiliki nilai mendekati 0,0.

C. Hubungan Gen Glutamyl-tRNA Amidotransferase Sub Unit B (GATB) dengan Diabetes Melitus Tipe 2

GATB merupakan gen yang terletak pada kromosom 4, GRCH 38.P13 dengan lokasi gen 4q13.3, dengan panjang 2369 pasang basa (bp) dan merupakan tipe gen pengkode protein. Gen GATB memiliki fungsi untuk pembentukan ATP, aktivitas sintesis glutamyl-tRNA dan sintesis protein. GATB merupakan sub unit dari Glutamyl-tRNA Amidotransferase yang memiliki aktivitas kinase yang bergantung pada tRNA [10].

Gen GATB (Glutamyl-tRNA Amidotransferase sub unit B) merupakan produk dari genosom yang berfungsi untuk melakukan sintesis glutamyl-tRNA yang digunakan untuk mengisi molekul mt-tRNA spesifik pada proses translasi mitokondria. Jika terjadi mutasi gen GATB maka akan terjadi kegagalan sintetase glutamyl mt-tRNA (mt-tRNA Glu) yang nantinya dapat menyebabkan gangguan translasi mitokondria yang pada akhirnya akan berpengaruh terhadap sintesis protein rantai respirasi sistem OXPHOS [11]. Pada penelitian Nagao, et al menyatakan bahwa gen GATB memiliki peranan penting dalam proses translasi mitokondria [10]. Gangguan sintetase glutamyl t-RNA pada penelitian Webb, et al tersebut dapat menyebabkan kardiomiopati dan asidosis laktat [11]. Sedangkan pada penelitian lain, yaitu penelitian Friederich, et al terdapat sembilan pasien kardiomiopati memiliki glutamyl-tRNA yang rusak [12].

Berdasarkan penelitian ini, telah ditemukan gen GATB (Glutamyl-tRNA Amidotransferase Sub unit B) pada alel positif penanda Diabetes Melitus Tipe II menggunakan Primer A18. Penelitian ini berhipotesis bahwa terdapat keterkaitan gen GATB terhadap pembentukan ATP yang diperlukan oleh sel beta pankreas dalam memproduksi insulin. Karena secara umum, jika gen GATB mengalami mutasi, maka akan menyebabkan terjadinya kegagalan sintetase glutamyl-tRNA yang kemudian dapat menyebabkan gangguan translasi mitokondria. Apabila terdapat cacat translasi mitokondria, maka akan mengganggu aktivitas kompleks rantai respirasi dalam proses fosforilasi oksidatif (OXPHOS), sehingga terjadi gangguan pada pembentuakan ATP mitokondria. Jika produksi ATP terdapat gangguan maka mitokondria tidak akan memproduksi ATP, hal ini akan berpengaruh buruk pada sel beta pankreas. Karena pada dasarnya mitokondria merupakan sumber ATP bagi sel beta pankreas dalam memproduksi insulin [13]. Polimorfisme nukleotida tungggal (SNP) pada DNA mitokondria akan menyebabkan beberapa gangguan kompleks. Gangguan mitokondria dapat dikatakan sebagai penyebab paling signifikan penyakit metabolisme dan degeneratif, penuaan dan kanker [14].

Namun keterkaitan gen GATB dengan Diabetes Mellitus Tipe II masih belum ada penelitian lebih lanjut. Hal ini dikarenakan belum ada penelitian tentang deteksi mutasi gen GATB pada beberapa titik mutasi tertentu, karena mutasi pada titik yang berbeda dalam tRNA mitokondria yang sama dapat mengakibatkan penyakit yang berbeda pula. Misalnya terjadi mutasi titik m.14709T > C pada gen MTTE (gen yang mengkode glu tRNA mitokondria) dapat menyebabkan Diabetes Mellitus dan tuli.Sedangkan mutasi pada titik m.14674T > G atau m. 14674T > C pada gen MTTE menyebabkan miopati mitokondria [11].

 Kesimpulan

Ditemukan gen GATB (Glutamyl-tRNA Amidotransferase Sub Unit B) sebagai gen yang teridentifikasi pada alel positif penanda Diabetes Melitus tipe II menggunakan Primer A18. Penelitian ini berhipotesis bahwa gen GATB (Glutamyl-tRNA Amidotransferase Sub Unit B) memiliki keterkaitan terhadap munculnya Diabetes Mellitus tipe II. Hal ini dibuktikan dengan adanya hubungan kompleks antara gen tersebut dengan pembentukan ATP oleh mitokondria. Terjadinya mutasi pada gen GATB akan memberikan gangguan kompleks pada mitokondria yang akhirnya berdampak pada gangguan dalam pembentukan ATP yang merupakan komponen yang diperlukan sel beta pankreas dalam memproduksi insulin.