Comparison of PCR (Polymerase Chain Reaction) Results Using DNA Template Isolation Results with Column and Resin Methods Perbandingan Hasil PCR (Polymerase Chain Reaction) Menggunakan DNA Template Hasil Isolasi dengan Metode Column dan Resin Apriliana Dinda dindaapril150499@gmail.com Mushlih Miftahul mif.mushlih@umsida.ac.id Indonesia Indonesia 30 10 2021 Pendahuluan

Biologimolekulermerupakanilmuyangmempelajarihal–halyangberkaitandenganaktivitasbiologipada level molekular termasuk interaksi antara perbedaan tipe DNA, RNA, Protein, dan biosistesisnya sehingga dapat digunakan untuk identifikasi DNA, identifikasi gen, identifikasi penyakit, pengobatan penyakit dan pencegahan penyakit dengan skrining awal suatu penyakit[1]. Penggunaan biologi molekular sebagai alat untuk mendeteksi penyakit berkembang dengan pesat dari tahun ke tahun. Pada tahun 2019 data indeks menjukkan transaksi diagnostik molekular secara global berkisar USD 9,2 miliar yang didomonasi oleh penjualan reagen dan penggunaan alat PCR. Pada tahun 2020 transaksi diagnostik molekular telah menyentuh angka USD 10,1 miliar dimana angka ini diprediksikan akan terus mengalami kenaikan dengan pesat[2]. Dengan demikian, diagnostik molekular memainkan peran penting dalam kehidupan dimana kasus terbaru yang banyak menggunakan diagnostik molekular sebagai gold standart adalah diagnosa virus Covid-19 yang saat ini tengah mewabah diseluruhdunia[3].

Maka dari itu,pada penelitian ini dilakukan perbandingan hasil PCR menggunakan DNA template hasil isolasi metode column dan resin untuk mengetahui metode isolasi DNA manakah yang paling efisien antara metode column dan resin menggunakan sampel wholeblood.

 Metode Penelitian

Peneliti telah melakukan uji kelayakan etik ke komisi etik fakultas Kedokteran Gigi Universitas Airlangga Surabya dengan nomor sertifikat : 189/HRECC.FODM/IV/2021. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler Universitas Muhammadiyah Sidoarjo pada bulan Februari sampai April 2021. Metode penelitian yang digunakan adalah deskripsi eksperimental. Penelitian ini menggunakan 8 sampel whole blood dimana 8 sampel tersebut diisolasi dengan menggunakan metode column dan metode resin. Penelitian ini dilakukan dengan cara quota sampling yaitu pengambilan sampel dari populasi jumlahnya ditetapkan oleh peneliti tanpa adanya syarat khusus. Sampel diuji secara kuantitatif dengan spek trofotometer UV-VIS dan secara kualitatif menggunakan PCR. Data yang diperoleh kemudian dianalisis secara statistik menggunakan uji T dependen dengan SPSS Versi16.

 Hasil dan Pembahasan

Hasil kuantifikasi pada tabel1menunjukkan bahwa kedelapan sampel memiliki kemurnian<1,8sehingga dapat dikatakan terkontaminasi oleh protein. Kedelapan sampel juga menunjukkan konsentrsi>50ng/µl yang artinya sudah memenuhi syarat.Suatu sampel dapat dikatakan murni apabila nilai absorbansi 260 terhadap nilai absorbansi 280 berada diantara 1,8 -2,0. Jika rasio <1,8 maka DNA dikatakan terkontaminasi oleh protein dan apabila rasionya >2,0 maka dikatakan terkontaminasi RNA. Sedangkan syarat konsentrasinya 50ng/µl[6].

Hasil Spektrofotometer Metode Column

No Kode sampel A260 A280 Kemurnian A260/A280 Konsentrasi (ng/µl)
1 C1 0,535 0,376 1,425 240,722
2 C2 0,450 0,296 1,523 202, 532
3 C3 0,426 0,282 1,514 191,846
4 C4 0,459 0,298 1,539 206,454
5 C5 0,456 0,306 1,490 205,355
6 C6 0,513 0,337 1,522 230,684
7 C7 0,500 0,325 1,537 244,950
8 C8 0,478 0,330 1,449 215,011

Pada tabel 2 menunjukkan bahwa kedelapan sampel hasil isolasi metode resin memiliki kemurnian <1,8 sehingga dapat dikatakan terkontaminasi protein. Sedangkan untuk konsentasi sampel, kedelapan sampel memiliki konsentrasi >50 ng/µl sehingga dikatan memenuhi syarat.

Pada uji statistik menggunakan uji T dependen dilakukan untuk melihat perbedaan indeks kemurnian serta konsentrasi DNA antar sampel. Sebelum dilakukan uji T dependen terlebih dahulu dilakukan uji normalitas. Berdasarkan uji normalitas pada konsentrasi DNA didapatkan hasil uji normalitas metode column dengan p-value sebesar 0,429(>0,05) dan pada metoderesin didapatkan hasilp-valuesebesar0,705(>0,05)yang artinya data tersebut terdistribusi normal. Setelah itu di lakukan uji T dependen dan didapatkan hasil untuk konsentrasi DNA dengan nilai p-value sebesar 0,169 (>0,05) sehingga dapat disimpulkan bahwa tidak terdapat perbedaan yang signifikan pada konsentrasi DNA yang diisolasi menggunakan metode column dan metode resin. Kemudian pada kemurnian DNA dilakukanujinormalitasmetodecolumnsehinggadidapatkanp-value sebesar 0,106(>0,05) dan padaresin didapatkan p value sebesar 0,680(>0,05) sehingga dapat dikatakan terdistribusi normal.Setelah itu dilakukan uji T dependen dan didapatkan nilaip-value sebesar 0,252(>0,05) hal ini berarti tidak terdapat perbedaan yang signifikan pada kemurnian DNA jika sampel diisolasi dengan metode column dan resin.

<bold id="_bold-20"/>Hasil Spektrofotometer Metode Resin

No Kode sampel A260 A280 Kemurnian A260/A280 Konsentrai (ng/µl)
1 R1 0,622 0,493 1,26 279,9
2 R2 0,588 0,441 1,33 264,6
3 R3 0,557 0,438 1,27 250,65
4 R4 0,629 0,487 1,29 282,99
5 R5 0,608 0,495 1,22 273,6
6 R6 0,749 0,633 1,28 336,83
7 R7 0,652 0,526 1,24 293,19
8 R8 0,708 0,579 1,22 318,53

Gambar 1. Elektoforesis DNA Genom Metode Column.

Keterangan : M (marker), C1 (column sampel ke-1), C2 (column sampel ke-2), C3 (column sampel ke-3), C4 (column sampel ke-4), C5 (column sampel ke-5), C6 (column sampel ke-6), C7 (column sampel ke-7), C8 (column sampel ke-8)

Berdasarkan gambar 1 hasil visualisasi menggunakan UV transiluminator pada DNA genom metode column menunjukkan adanya pita DNA dengan kode C1, C2, C4, C5, dan C6 dengan ketebalan pita cukup jelas, sampel sengan kode C7 dan C8 menunjukkan terbentuknya pita yang tipis dan pada sampel dengan kode C3 tidak terbentuk pita. Pita DNA yang terbentuk pada gel agarosa yang terlihat jelas maupun tipis menunjukkan jumlah DNA genom pada setiap sampel. Semakin tebal band maka semakin banyak DNA[7]. Tidak muncul nyapita DNA pada gelagarosa kemungkinan terjadi karena kuantitas DNA yang terambil terlalu sedikit sehingga DNA tidak terbaca[8]. Pada elektroforesis DNA genom dilakukan untuk mengetahui ada atau tidaknya DNA , apabila terbentuk pita DNA maka dapat dilanjutkan ke tahap amplifikasi menggunakanPCR.

Gambar 2. Elektoforesis DNA Genom Metode Resin.

Keterangan : M (marker), R1 (resin sampel ke-1), R2 (resin sampel ke-2), R3 (resin sampel ke-3), R4 (resin sampel ke-4), R5 (resin sampel ke-5), R6 (resin sampel ke-6), R7 (resin sampel ke-7), R8 (resin sampel ke-8).

Berdasarkan gambar 2 hasil visualisasi menggunakan UV transiluminator pada DNA genom metode resin menunjukkan tidak adanya pita DNA dengan kode R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 dan R8. Hal ini kemungkinan dikarenakan jumlah DNA yang sangat sedikit sehingga tidak terbaca pada elektroforesis gel agrosa[9].

Gambar 3. Hasil elektroforesis produk PCR Metode Column.

Keterangan: M (marker ladder) 100 bp,C1 (column sampel ke-1), C2 (column sampel ke-2), C3 (column sampel ke- 3), C4 (column sampel ke-4), C5 (column sampel ke-5), C6 (column sampel ke-6), C7 (column sampel ke-7), C8 (column sampel ke-8).

Berdasarkan gambar 3 hasil visualisasi menggunakan UV transiluminator pada produk PCR yang menggunakan metode column menunjukkan adanya pita DNA dengan kode C1, C2, C4, C6, C7 dan C8 dengan ketebalan pita yang cukup tebal dan jelas. Hasil yang cukup tebal dan jelas yang diperoleh sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Marwayana pada tahun 2015 dimana pada metode column menggunakan membranesilika untuk berikatan dengan DNA sehingga menjadikan metode ini mempunyai kemurnian yang lebih tinggi sehingga metode ini menjadi lebih optimal. Akan tetapi pada sampel dengan kode C3 dan C5 tidak terbentuk pita dan tidak munculnya pita DNA pada kode sampel C3 dan C5 kemungkinan diakibatkan oleh kurangnya kuantitas DNA yang terambil saat proses persiapan amplifikasi DNA menggunakan PCR sehingga mempengaruhi hasilPCR.

Gambar 4. Hasil elektroforesis produk PCR Metode Resin.

Keterangan: M (marker ladder) 100 bp, R1 (resin sampel ke-1), R2 (resin sampel ke-2), R3 (resin sampel ke-3), R4 (resin sampel ke-4), R5 (resin sampel ke-5), R6 (resin sampel ke-6), R7 (resin sampel ke-7), R8 (resin sampel ke-8).

Berdasarkan gambar 4 hasil visualisasi menggunakan UV transiluminator pada produk PCR yang menggunakanmetoderesinmenunjukkanadanyapitaDNAdengankodeR1,R2,R4,R6,R7danR8denganketebalan pita yang tipis.

Hasil ketebalan pita yang tipis kemungkinan berkaitan dengan proses isolasi yang menggunakan metode resin dimana metode ini memiliki kelemahan diantaranya adalah jumlah DNA yang dihasilkan cukup sedikit serta adanya tahap pemanasan selama proses ekstraksi sehingga struktur rantai ganda DNA (denaturasi) yang dihasilkan menjadi rusak[9]. Hal ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Sutrisno et al. pada tahun 2013 dimana ia melakukan identifikasi bite marks dengan isolasi DNA metode resin dan hasilnya terbentuknya pita tipis pada agarosa dengan konsentrasi rata-rata 52,61 ng/µl. Sedangkan pada sampel dengan kode R3 dan R5 tidak terbentuk pita kemungkinan terjadi karena terlarutnya chelating agent yang dipakai pada metode resin. Bahan chelating agent mempunyai sifat yang dapat mengikat ion-ion Mg2+ yang mempunyai fungsi sebagai kofaktor dari enzim taq polymerase yang sangat diperlukan pada proses amplifikasi PCR. Kinerja dari tag poly merasakan tidak normal apabila masih terdapat bahan chelating resin masih terdapat pada larutan DNA. Selain itu chelating resin atau Chelex mempunyai sifat yang dapat merusak protein atau protein denaturant. Padahal enzim taq polymerase itu sendiri adalah sejenis protein yang berfungsi sebagai enzim katalis dalam proses PCR. Taq polymerase yang telah mengalami kerusakan akibat adanya chelating resin, dapat dipastikan bahwa kinerja dari PCR tidak akan optimal atau bahkan tidak dapat berlangsung. Sehingga tidak munculnya gambaran band atau pita dari DNA yang telah digandakan namun tidak munculnya pita DNA juga dapat disebabkan adanya kesalahan yang dilakukan oleh peneliti pada proses ekstraksi maupunPCR.

Metode resin sering digunakan pada sampel yang berupa darah. Selain adanya kelemahan pada metode resin ada pula beberapa kelebihan metode resin dimana prosesnya cepat serta resiko untuk terkontaminasi karena penggunaan banyak tabung dapat dihindari karena tahapan yang dilakukan lebih sederhana[11].

 Kesimpulan

Kesimpulan dari penelitian ini adalah berdasar kan uji kuantitatif DNA pada sampel DNA yang diisolasi dengan menggunakan metode column memiliki kemurnian yang lebih tinggi dibandingkan dengan metide isolasi metoderesin yang artinya pada metoderesin terdapat banyak kontaminasi. Namun,dalam hal konsentrasi metoderesin mempunyai konsentrasi yang lebih tinggi dibandingkan dengan metode column dan tidak terdapat perbedaan yang signifikan pada kemurnian dan konsentrasi DNA jika sampel diisolasi dengan metode column dan metode resin (r=0.169, r=0.252) setelah dilakukan uji T dependen. Pada analisis menggunakan PCR sampel yang diisolasi dengan metode column menunjukkan band yang cukup jelas dibandingkan dengan metoderesin.